液相色譜法測定維生素A、維生素D3（VA和VD3）

維生素A（VA）、維生素D3（VD3）、維生素E（VE）和β-胡蘿卜素是維持人體正常生理活動(dòng)和機能的脂溶性維生素，缺乏這些維生素會(huì )導致多種疾病。流行病學(xué)研究資料表明，脂溶性維生素與癌癥發(fā)生有著(zhù)相應的關(guān)系

  食道癌是世界八大癌癥之一，而我國又是食管癌的高發(fā)地區，每年因食管癌死亡者約15萬(wàn)人，但有關(guān)食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)報道。通過(guò)測定和比較食道癌病人和正常人血清中脂溶性維生素的含量，可以了解食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系，為指導病人正確地補充維生素

提供實(shí)驗室依據。目前我國尚無(wú)測定血清中脂溶性維生素的標準方法。

HPLC因其具有高分離效能、靈敏快速、可自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于食品等樣品中脂溶性維生素的測定，而同時(shí)測定人血清中VA、VD3、VE和β-胡蘿卜素四種脂溶性維生素的報道甚少。因此，本課題組擬建立HPLC同時(shí)測定VA、VD3、VE和β-胡蘿卜素的方法，并應用于食道癌病人和正常人血清樣品的測定，為研究食道癌的發(fā)生與血清中脂溶性維生素之間的關(guān)系提供簡(jiǎn)單可行的實(shí)驗技術(shù)和數據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑液相色譜儀附紫外檢測器、吹氮儀、視黃醇、維生素D3、α-生育酚和β-胡蘿卜素標準品  1mg/ml

維生素標準貯備液配制：分別精密稱(chēng)取視黃醇、VD3、α-生育酚、β-胡蘿卜素各0.025g于25ml容量瓶中，視黃醇、VD3和α-生育酚用甲醇，β-胡蘿卜素用二氯甲烷溶解并定容到刻度，搖勻備用。

1.2 

實(shí)驗方法

1.2.1 

色譜條件   色譜柱：C18柱；柱溫25℃；流動(dòng)相：甲醇:二氯甲烷:乙腈（10:20:70）；流動(dòng)相程序：

0~12min  流速1.0~1.5ml/min  線(xiàn)性變化，12min~17min  保持流速 1.5ml/min，17min

流速回到1.0ml/min；檢測 波長(cháng)切換程序：0~6min為324nm，6min~8 min為263nm，8~12min為291nm，12min后為462nm; 1.2.2 標準曲線(xiàn)的繪制分別取適量維生素標準溶液，用流動(dòng)相稀釋成濃度不同的標準系列，10μl進(jìn)樣測定，以維生素標準溶液濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)或進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

1.2.3 樣品測定0.2ml血清中加入0.2ml無(wú)水乙醇沉淀蛋白質(zhì)，0.8ml已醚/石油醚混合溶液提取，振搖1min后15000r/min離心2min；取上清液0.6ml，氮氣吹干，0.10ml流動(dòng)相溶解殘渣，漩渦振蕩器振蕩30s，15000r/min離心2min，取25μl上清液進(jìn)樣測定。標準和樣品色譜圖如圖1